EVs的分类和生物成因
EV有三种生物类型，即外泌体、微囊泡和凋亡小体，由其生物成因决定，如下文和图1所述。然而，本综述使用了EV的通用术语，除非该研究讨论的EV制备的特征是使用ISEV定义EV的最低实验要求中概述的方法(BOx1)。
外泌体
转运所需的内体分选复合物(ESCRT)蛋白包括ESCRT-0(肝细胞受体酪氨酸激酶底物(HRS);也被称为VPS27)，ESCRT-I(肿瘤易感基因101(TSG101))，ESCRT-II(VPS25)和ESCRT-III(CHMP4A,CHMP4B和CHMP4C)参与recruitingcargo和形成晚期内囊体膜的内陷。
ESCRT-0、ESCRT-I和ESCRT-II负责识别泛素化物质并将其装载到核内体腔内。ESCRT-II蛋白激活ESCRT-III的组装，后者募集辅助蛋白如ALG-2—相互作用蛋白X(ALIX)和VPS4来协调MVBs中腔内囊泡(ILVs)的形成。ESCRT非依赖性途径也可以通过鞘磷脂酶水解和中性鞘磷脂酶2(nSmase2)形成神经酰胺来介导MVB的内出芽。神经酰胺诱导MVB膜自发负曲率形成ILVs。然后MVB与细胞膜融合并释放ILVs(现在定义为外泌体或“外泌体样囊泡”)到细胞外空间。RAS相关蛋白RAB27A和RAB27B都是质膜分泌外泌体所必需的。ILVs在MVB中形成过程中，可包装胞内体蛋白、胞质蛋白以及反映亲本细胞的特定蛋白和基因组物质。四跨膜蛋白(如CD63)具有指导EV包载物质的作用，因为它们参与了质膜和几种细胞器之间的回收途径。
Box1|EV表征研究进展
由同一细胞类型产生的细胞外囊泡(ev)将会包含重叠的蛋白质组学和基因组内含物，并且识别不同类型EV的高度特异性内含物也具有挑战性。最初，对大小和形态的分析足以将EV制剂定义为外泌体或微囊泡。然而，EV制剂的异质性要求改进EV命名法，系统地通过大小和根据细胞类型富集某些内含物和标记物来表征EV制剂。国际细胞外囊泡学会(ISEV)已经发布了指南，以帮助研究人员使用一系列方法来表征EVs。在研究生物体液时，表征更加复杂，其中细胞外蛋白质和核酸可以在EVs保护膜外的体液中循环。
最近，据估计，小EVs在循环系统中以每小时每个细胞100个颗粒的速度分泌；在体外，每个细胞或200个颗粒。这些都是研究和量化系统中EVs动力学的令人钦佩的尝试。然而，确定大脑神经元网络或器官细胞中分泌的EVs的数量几乎是不可能的。尽管如此，对EVs基础生物学的深入研究已经为理解EVs在疾病中的作用以及EVs是否可以用于诊断和治疗铺平了道路。
在去除凋亡小体和微囊泡(下文讨论)后，通常通过10万g超速离心法分离出小EVs。它们可以通过Optiprep梯度使用速率区域离心来进一步纯化，以分解小的囊泡。小EVs富含四次跨膜蛋白(CD63,CD9和CD81)、膜转运蛋白(RAB蛋白和膜联蛋白)和参与MVB形成的蛋白(ALIX,TSG101和网格蛋白)。蛋白质分选机制的组成部分(如与ESCRT通路相关的组成部分)也可在EV制备中检测到，并可用于提高确定分离出的EV亚型的信心。这些蛋白的存在有助于区分正在研究的EVs可能是表达经典外泌体标志物(如CD63、CD9和CD81)的小EVs，还是不表达这些四次跨膜蛋白的非经典外泌体。
微囊泡
从细胞脱落的微囊泡大小从150nm到大于1000nm不等，平均大小为250-400nm，可称为大EVs。微囊泡是通过细胞膜向外出芽产生的，而后分离并形成囊泡(图1)。胞质生物分子的特异性胞吐是随机的，但在微囊泡出芽发生之前，膜蛋白和受体靶向于质膜。膜的出芽发生在质膜的特定位置，并受到磷脂再分布、Rho激酶介导的肌球蛋白轻链磷酸化和囊泡挤压和脱离的收缩机制的影响。微囊泡典型特征是脂质组成、质膜受体和反映其细胞起源的分子。微囊物由被运送到质膜的生物分子组成，通常包含碎片核糖体RNA(rRNA)和mRNA。微囊泡可以从条件介质和生物液中分离出来，方法是首先去除凋亡小体，然后以10,000g离心上清液。相似大小的微泡和微粒在细胞生物学中得到了广泛的研究，因为它们很容易被常见的方法检测到，如透射电子显微镜(TEM)和荧光激活细胞分选(FACS)。
Box2|EV介导的RNA转移
新的细胞系统被用于研究细胞外囊泡(EV)转移、EV摄取和内化。例如，使用基于Cre-重组酶的方法，利用高分辨率活体成像直接观察到CD63+EVs在高转移细胞系MDA-MB-231细胞之间的功能性mRNA交换。利用基于CRISPR–Cas9的报告系统，我们使用一个名为“CROSS-FIRE”的CRISPR操作的信号灯系统，观察到由小EV(ALIX,FLOT1,TSG101,CD9和CD63阳性)介导的小的非编码RNA转移。EV是否能转运功能性RNA仍存在争议。
虽然在上述研究中观察到Cre或单链向导RNA的转移，但这并不能证实内源性mRNA的功能性转移，并且受体细胞的摄取百分比非常低(小于0.1%和0.25%)。使用这些报告系统，再加上用于标记EV表面蛋白的更敏感读出值(如单细胞RNA测序和细胞哈希)，可能提高关于EV介导的RNA转移在受体细胞中是否有效的分辨率。另一个因素是在受体细胞中产生功能性影响所需的EVmRNA或microRNA(miRNA)的生物负荷，因此EV的潜在摄取可能是一种罕见事件。
据报道，血浆EVs内miRNAs的化学计量小于1拷贝数。从潜伏感染EBV的人淋巴母细胞B细胞系中分离出含有EBV病毒miRNA的EVs，在300~16,000个EVs中观察到一个拷贝的miRNA。用HEK293T报告细胞增加纯化的人淋巴母细胞B细胞系EVs的剂量没有显示任何荧光素酶活性，这表明任何递送到受体细胞的miRNA都没有功能活性，并且没有足够的数量来调节其靶向mRNA。
随着我们在临床中观察到治疗性EVs的使用，在未来十年的EV研究中，其中许多保留可能会得到解答。多项基于RNA的疗法(包括反义寡核苷酸和小干扰RNA[siRNA])已获得批准，并且在新型COVID19mRNA疫苗BNT162b1(辉瑞)和mRNA-1273(Moderna)开发之后，人们对这一领域的兴趣被点燃，这两种疫苗被制备成脂质纳米颗粒。疫苗内的mRNA剂量水平可能为发挥功能效应所需的mRNA-EV比值提供线索。在COVID19mRNA疫苗中观察到的脂质纳米颗粒摄取也可能有助于确定EV摄取的最有效机制。在异质性EVs群体中分析单EV水平的表面受体可能有助于我们了解如何修饰EVs并将其用作基于RNA的治疗的递送载体。
凋亡小体
凋亡小体是EV中最大的一类，大小为1~5μm。它们是通过细胞死亡过程中凋亡细胞膜的特征性滤泡和突出来产生的(图1)。在正常生理信号或致病过程触发的程序性细胞死亡后，膜滤泡形成凋亡突起，即微管尖刺、凋亡蛋白和串珠状凋亡蛋白。这些突起分解形成凋亡小体，包住整个细胞器、核基因组DNA、核酸碎片和随机包住的物质。通常，凋亡小体是通过巨噬细胞识别质膜标记物后的吞噬作用去除的。
